INTERFERON ALPHA 2

Inteferoni alfa 2

 

Giới thiệuĐịnh nghĩa

Inteferon alpha 2 là sinh phẩm ở dạng nước hoặc đông khô có chứa inteferon alpha- 2, người, tái tổ hợp.

Inteferon alpha 2 dạng nước là dung dịch trong suốt, không màu.

Inteferon alpha 2 đông khô có dạng khối xốp, trắng mịn, dễ hoà tan trong nước thành dung dịch trong suốt.

Inteferon alpha 2 được dùng để kháng virutvirus, ức chế tăng sinh tế bào ung thư và có chức năng điều hoà miễn dịch.

 

Sản xuất

Inteferon alpha 2 được sản xuất theo công nghệ ADN tái tổ hợp ADN: Gen mã hoá Inteferon alpha 2 được tách từ tế bào lymphocyte của người và đưa vào vector biểu hiện; sau đó, vector này được đưa vào vi khuẩn thuần hoá vào genom của vi khuẩn. Vi khuẩn này tái tổ hợp được nhân nuôi cấy trong môi trường đặc biệt để thu sinh khối và sau đó dùng kỹ thuật sinh hoá tách chiết và tinh sạch interferon alpha 2. Sản phẩm được đóng ống và đông khô với hàm lượng Inteferon alpha 2 khác nhau, tuỳ theo mục đích sử dụng.

 

Nhận dạng

Inteferon alpha 2 được nhận dạng thông qua sự giảm hoạt tính kháng virutvirus của nó trên tế bào bị giảm nhiễm sau khi bị trung hoà với kháng thể đơn dòng kháng inteferon alpha 2.

Phương pháp tiến hành:

- Vật liệu:

Inteferon alpha 2 thử nghiệm.

Kháng thể đơn dòng kháng Inteferon alpha 2.

Tế bào MDBK (Madin -Darby Bovin Kidney - Tế bào thận bò).

VirutVirus gây nhiễm VSV (Vesicular Stomatitis Virus - VirutVirus gây viêm vòm họng) đã chuẩn độ.

Môi trường MEM (Munimum Essential Medium) có chứa huyết thanh bào thai bê FBS (Fetal Bovin Serum, FBS).

Trypsin 0,25%.

Phiến nhựa vô trùng, 96 giếng đáy bằng.

Một số dụng cụ khác: chai lọ, các tube thuỷ tinh, pipet…

- Phương pháp Ttiến hành:

Ngày thứ 1:

Pha kháng thể đơn dòng kháng Inteferon alpha 2 với môi trường MEM 2% FBS để có dumh dịch chứa 200 IU/ml.

Trộn đểu đều 3-5 lọ mẫu thử nghiệm và pha loãng bằng MEM (có 2% FBS) để có dung dịch chứa khoảng 200 IU/ml (tùy vào hàmg lượng Inteferon alpha 2 ghi trên nhãn).

Pha kháng thể đơn dòng với môi trường MEM 2% FBS để có dung dịch chứa 200 IU/ml.

Trung hòaoà: Trộn đều 1ml Inteferon alpha 2 đã pha loãng ở trên với 1ml kháng thể đơn dòng kháng Inteferon alpha 2.

 Ủ ở 37 ^oC trong 60 phút.

Nhỏ 100 ml mcl môi trường MEM 5% FBS  vào tất cả các giếng.

Nhỏ 100 ml mcl từ dung dịch đã pha loãng của mẫu thử nghiệm đã pha loãng ở trên vào giếng thứ nhất của phiến (A1). Pha loãng tiếp bậc 2 cho đến hàng giếng thứ 12 (A12), loại bỏ 100 ml ở giếng A12.

Nhỏ 100 ml dung dịch mẫu thử nghiệm đã trung hòa với kháng thể đơn dòng kháng Inteferon alpha 2 vào hàng giếng thứ hai của phiến (B1). Pha loãng tiếp bậc 2 cho đến hàng giếng thứ 12 (B12), loại bỏ 100 ml ở giếng B12.

và dung dịch đã trung hoà vào mỗi giếng trong cột thứ nhất của phiến.

Pha loãng bậc 2 liên tiếp cho đến cột thứ 12 thì loại bỏ 100 mlmcl.

Nhỏ 100 ml mcl dung dịch tế bào MDBK có nồng độ 6-8 x 10⁵ tế bào/ml vào toàn bộ các giếng.

Phủ giấy dán, đậy nắp phiến và để ở tủ ấm 37^oC37 ^OC, 5% CO²  trong vòng 18-24 giờ.

Ngày thứ 2:

Kiểm tra sự phát triển của tế bào MDBK ở các giếng chứng “ tế bào” chứng, ,tế bào dưới kính hiển vi, phải mọc được một lớp kín.

Loại bỏ nước nổi trong tất cả các giếng của phiến.

Pha dung dịch virutvirus gây nhiễm VSV với môi trường MEM  2 %  FBS để có chứa 100 -200 CCID₅₀/ml.

 Nhỏ 100 ml mcl dung dịch tế bàovirus gây nhiễm VSV này vào tất cả các giếng. trừ giếng chứng “tế bào”.

 

Phủ giấy dán, đạy nắp phiến và để ủ ở tủ ấm 37^oC37 ^OC, 5% CO₂  trong vòng 18-24 giờ.

Ngày thứ 3:

Kiểm tra sự huỷ hoại của tế bào nhiễm virutvirus đối với tế bào dưới kính hiển vi, ở các giếng chứng “virutvirus”nhỏ dung dịch  Inteferon alpha 2 sau trung hòa, tỷ lệ hủy hoại tế bào phải đạt trên 90%.

Nhuộm tế bào với tím gentian.

 Để phiến khô ở nhiệt độ phòng.

 Nhỏ 50 ml mcl 2-methoxyethanol vào tất cả các giếng.

 Lắc nhẹ phiến trên máy lắc trong vòng 10 phút.

 Đo độ hấp thụ (OD) (Phụ lục 4.1) ở bước sóng 540 nm bằng máy đọc ELISA.

-  Tiêu chuẩn đánh giá:

 So sánh độ hấp phụ quang học giữa các giếng tương ứng của 2 loại dung dịch thử nghiệm trước và sau khi trung hoà với kháng thể đơn dòng kháng Inteferon alpha 2: đĐộ hấp pthụ quang học của các giếng sau trung hoà phải nhỏ hơn.

 

An toàn chung

Xem Phụ lục …chuyên luận chung., . vVới liều tiêm là 15 triệu IUđơn vị quốc tế/5 ml đối với 1 chuột lang và 1 triệu IUđơn vị quốc tế/0,5 ml đối với 1 chuột nhắt.

Hiệu giá

Hiệu giá Inteferon alpha 2 được xác định bằng chuẩn độ hoạt tính kháng virutvirus của mẫu thử nghiệm trên tế bào MDBK.

Hiệu giá của Inteferon alpha 2 thử nghiệm được tính theo mẫu chuẩn quốc tế Inteferon alpha 2 tái tổ hợp.

Phương pháp tiến hành:

- Vật liệu:

Inteferon alpha 2 chuẩn quốc tế

Inteferon alpha 2 thử nghiệm

Tế bào MDBK.

VirutVirus gây nhiễm VSV-Vesicular Stomatitis Virus) đã chuẩn độ.

Môi trường MEM có chứa huyết thanh bào thai bê FBS.

Phiến nhựa vô trùng, 96 giếng, đáy bằng.

- Một số dụng cụ khác: chai lọ, các tube thuỷ tinh, pipet

Phương pháp tiến hành:

- Tiến hành:

Ngày thứ 1:

Pha loãng mẫu chuẩn quốc tế với MEM 2% FBS để có dung dịch chứa 100 đơn vị quốc tế (IU)/ml

Trộn đều 3-5 lọ mẫu thử nghiệm và pha loãng bằng MEM 2% FBS để có dung dịch chứa khoảng 100 IU/ml (tuỳ vào hàm lượng Inteferon alpha 2 ghi trên nhãn).

Nhỏ 100 ml mcl môi trường MEM 5% FBS vào tất cả các giếng.

Nhỏ 100 ml mcl từ dung dịch đã pha loãng của mẫu chuẩn quốc tế (MCQT) và mẫu thử nghiệm vào mỗi giếng trong cột thứ nhất của phiến. Đối với MCQT nhỏ 2 giếng và mẫu thử nghiệm nhỏ 4 giếng.

Pha loãng bậc 2 liên tiếp cho đến cột thứ 12 thì loại bỏ 100 mlmcl.

 

Nhỏ 100 ml mcl dung dịch tế bào MDBK có nồng độ 6-8 x10⁵ tế bào/ml vào toàn bộ các giếng. .

 

Phủ giấy dán, đậy nắp phiến và để ở tủ ấm 37^oC37 ^OC, 5% CO₂  trong vòng 18-24 giờ.

Ngày thứ 2:

Kiểm tra sự phát triển của tế bào MDBK ở các giếng chứng “tế bào”, dưới kính hiển vi,tế bào phải mọc được một lớp kín.

Loại bỏ nước nổi trong tất cả các giếng của phiến.

Pha dung dịch virutvirus gây nhiễm VSV với môi trường MEM 2% FBS để có chứa 100 - 200 CCID₅₀/ml.

 Nhỏ 100 ml mcl dung dịch virus gây nhiễm VSV tế bào vào tất cả các giếng trừ giếng chứng “tế bào”.

Phủ giấy dán, đậy nắp phiến và để ở tủ ấm 37^oC37 ^OC, 5% CO₂  trong vòng 18 - 24 giờ.

Ngày thứ 3:

Kiểm tra sự huỷ hoại của virutvirus đối với tế bào , dưới kính hiển vi, ở các giếng chứng “virutvirus”tỷ lệ hủy hoại : phải đạt trên 90%.

Nhuộm tế bào với tím gentian.

 Để phiến khô ở nhiệt độ phòng.

 Nhỏ 50 ml mcl 2-methoxyethanol vào tất cả các giếng.

 Lắc nhẹ phiến trên máy lắc trong vòng 10 phút.

 Đo độ hấp thụ  (OD) ( Phụ lục 4.1) ở bước sóng 540 nm bằng máy đọc ELISA.

- Cách  tTính kết quả:

- Tính độ hấp tphụ 50%:

Theo công thức

A_50% = (A_c + A_v)/2

Trong đó:         A_c: Độ hấp thụphụ trung bình của các giếng chứng “tế bào”

                                       A_v: Độ hấp tphụ trung bình của các giếng chứng “virutvirus”

-- Xác định hiệu quả bảo vệ 50% tế bào của Inteferon alpha 2 mẫu thử nghiệm và mẫu chuẩn quốc tế:

Theo công thức

N ==  n + (A_n - A_50%)/(A_n - A_n+1)

Trong đó:

N: Số thứ tự của giếng có độ bảo vệ tế bào 50%

n: Số thứ tự của giếng có độ hấp phthụ >50%

A_n: Độ hấp thphụ của giếng thứ “n”

                        A_n+1: Độ hấp tphụ của giếng thứ “n+1”

- Tính hiệu giá :

                        Ttheo công thức:

      

                           Hiệu giá (%) = 100 x 2^{(Ntn - Ns)}

Trong đó:

Ntn: Vị trí giếng mà ở đó Inteferon alpha 2 thử nghiệm bảo vệ được 50% tế bào

Ns: Vị trí giếng mà ở đó Inteferon alpha 2 chuẩn quốc tế bảo vệ được 50% tế bào

5.4. Tiêu chuẩn đánh giá:á

 Mẫu Inteferon alpha 2 thử nghiệm chỉ đạt yêu cầu khi hiệu giá tính được phải đạt từ 70% đến 150% hàm lượng ghi trên nhãn.

 

An toàn chung

Với liều tiêm là 15 triệu IU/5 ml đối với 1 chuột lang và 1 triệu IU/0,5 ml đối với 1 chuột nhắt (. Phụ lục 15.11).

 

Chất gây sốt

Mẫu Inteferon alpha 2 thử nghiệm được pha loãng với nước muối sinh lý, ý 0,85 để có nồng độ 600.000 IU/ml (. Thử nghiệm xem Phụ lục … và thử nghiệm được thực hiện theo chuyên luận chung.15.12).

 

Vô trùng

Xem Phụ lục …chuyên luận chung.15.7.

 

Độ ẩm tồn dư (đối với dạng đông khô)

Không lớn hơn 5% .

Xem (Phụ lục …chuyên luận chung.15.35).

 

pH:

7,0 ± 0,5 (

 (Xem Phụ lục …chuyên luận chung).15.33).

 

AND tồn dư???

Cách dùng, liều lượng

Tiêp bắp hoặc tiêm dưới da.

Liều lượng tuỳ theo mục đích sử dụng.

 

Đóng gói, bảo quản

Đóng gói: hàm lượng Inteferon alpha 2 được đóng gói tuỳ theo nhà sản xuất: 3 triệu IUđvqt/lọ, 6 triệu IUđvqt/lọ;, 90 mgmcg/lọ, 180 mg mcg/lọ …, kèm theo nước hồi chỉnh.

Inteferon alpha 2 đông khô phải được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 ^oC đến 8 ^oC, tránh ánh sáng.