VACXINVắC XIN  TẢ UỐNG BẤT HOẠT

Oral cholera vaccine

 

 

Định nghĩa

VacxinVắc xin  tả uống bất hoạt là một chế phẩm vô khuẩn sinh học được điều chế từ vi khuẩn tả toàn tế bào đã bất hoạt bằng formaldehyde hoặc nhiệt độ.

Mỗi liều 1,5 ml vacxinvắc xin  tả uống gồm:

- 25 tỉ vi khuẩn V. cholerae týp sinh học cổ điển, týp huyết thanh Inaba (chủng 569B)

- 25 tỉ vi khuẩn V. cholerae týp sinh học cổ điển, týp huyết thanh Ogawa (chủng Cairo 50)

- 50 tỉ vi khuẩn V. cholerae  týp sinh học El Tor, týp huyết thanh Inaba (chủng Phil. 6973)

- 50 tỉ vi khuẩn V. cholerae O139 týp sinh học mới (chủng 4260B)

 

Sản xuất

Chủng sản xuất:

Các chủng sản xuất (V. cholerae týp sinh học cổ điển, týp huyết thanh Inaba (chủng 569B), V. cholerae týp sinh học cổ điển, týp huyết thanh Ogawa (chủng Cairo 50), V. cholerae  týp sinh học El Tor, týp huyết thanh Inaba (chủng Phil. 6973), V. cholerae, O139 týp sinh học mới (chủng 4260B) dùng để sản xuất vacxinvắc xin  tả uống phải được cơ quan kiểm định quốc gia chấp nhận.

Nhận dạng và tính thuần khiết của chủng sản xuất: Xác định chỉ có vi khuẩn V. cholerae (với các týp sinh học trên), là trực khuẩn Gram âm, mảnh, hơi cong. Trên môi trường thạch máu: khuẩn lạc tròn, bóng, hơi lồi. Có khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch TCBS. Lên men đường Saccharose và Mannose, không lên men đường Arabinose.

Kiểm tra chủng sản xuất bằng phản ứng ngưng kết huyết thanh:

Đánh dấu các vị trí trên lam kính. Nhỏ 20 µl kháng huyết thanh (polyvalent, Inaba, Ogawa, O139) và nước muối sinh lý (K) vào các vị trí đã được đánh dấu trên lam kính. Nhỏ 20 µl canh khuẩn tả vào mỗi loại kháng huyết thanh trên. Trộn đều và đọc kết quả.

- Tiêu chuẩn chấp thuận:

Chủng	Polyvalent	Inaba	Ogawa	O139	K
V. cholerae O1, El Tor, Phil. 6973	+	+	-	-	-
V. cholerae O139, 4260B	-	-	-	+	-
V. cholerae O1, 569B	+	+	-	-	-
V. cholerae O1, Cairo 50	+	-	+	-	-

 

Kiểm tra chủng sản xuất vắcxin tả trên thạch TCBS:

Lắc đều tuýp chứa canh khuẩn tả, nhỏ 0,1 ml canh khuẩn vào đĩa thạch TCBS, dùng que cấy cấy ria trên đĩa thạch. Ủ các đĩa thạch ở nhiệt độ 32,5±2,5^OC trong 48 giờ. Theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc và sự chuyển màu của môi trường nuôi cấy tại thời điểm 24 giờ và 48 giờ. Đọc kết quả sau 48 giờ.

- Tiêu chuẩn chấp thuận: khuẩn lạc trong, môi trường TCBS từ màu xanh lá cây chuyển màu vàng.

Kiểm tra tính chất sinh vật hóa học của chủng sản xuất:  

Lắc đều tuýp chứa canh khuẩn tả, cấy 0,1 ml vào từng ống môi trường (Arabinose, Mannose, Saccharose). Ủ các ống môi trường ở nhiệt độ 32,5±2,5^OC trong 48 giờ, theo dõi sự chuyển màu của môi trường. Đọc kết quả sau 48 giờ.

- Dương tính (+): Môi trường chuyển sang màu vàng.

- Âm tính (-): Môi trường giữ nguyên màu ban đầu.

Tiêu chuẩn chấp thuận: Tính chất sinh vật hóa học của tất cả các chủng sản xuất vắc xin tả: Arabinose (-), Mannose (+), Saccharose (+).

 

 

Sản xuất:

Vi khuẩn tả được nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Kết thúc nuôi cấy, canh khuẩn được kiểm tra độ thuần khiết, đo đậm độ vi khuẩn. Vi khuẩn tả được bất hoạt bằng formaldehyde hoặc nhiệt độ tùy từng chủng. Sau bất hoạt, vi khuẩn tả được thu bằng phương pháp li tâm hoặc lọc tiếp tuyến (TFF).

 

 

Kiểm định vacxinvắc xin  bán thành phẩm

*Thử nghiệm V vô khuẩn:

Phương pháp tiến hành: Phụ lục … (15.7).

* Kiểm tra sau bất hoạt:

 

Phương pháp tiến hành: Phụ lục … (15.5)Lắc đều tuýp chứa canh khuẩn tả sau bất hoạt, cấy 0,5 ml canh khuẩn tả vào đĩa thạch máu ngựa 15%, láng đều. Mỗi mẫu thử cấy trên 02 đĩa thạch máu. Ủ các đĩa thạch trên vào tủ ấm 32,5±2,5^OC trong 48 giờ. Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn tả tại thời điểm 24 giờ và 48 giờ.

 

Tiêu chuẩn chấp thuận: không thấy sự phát triển của vi khuẩn tả trên đĩa thạch máu ngựa.

* Đo đậm độ vi khuẩn:(bằng bộ soi độ đục chuẩn)

Phương pháp tiến hành: Phụ lục … (15.5) Trộn kỹ mẫu nước cốt tả trên máy trộn. Dùng pipetman hút 100µl mẫu thử cho vào ống thử của bộ soi độ đục, cho dần dần (X) ml dung dịch pha loãng (PBS 0,01M (pH=7,2) hoặc nước muối sinh lý) vào cho đến khi độ đục của ống thử bằng với độ đục của ống chuẩn số 10. Đậm độ vi khuẩn tả được tính như sau:

- Quy đổi thành 1 ml ta có: 0,1 ml nước cốt  +  X ml dung dịch pha loãng   x  10 = Y ml

- Đậm độ của mẫu cần đo = (Y ml  x  2,2)  x  10⁹ vi khuẩn/ml (ống số 10 của bộ soi độ đục chuẩn tương đương 2,2 x 10⁹ vi khuẩn/ml).

 

 

Kiểm định vacxinvắc xin  bán thành phẩm cuối cùng

*Thử nghiệm V vô khuẩn:

Phương pháp tiến hành: Phụ lục … (15.7).

*Thử nghiệm  aAn toàn không đặc hiệu:

Thử nghiệm tăng trọng trên chuột nhắt trắng Swiss.

Phương pháp tiến hành: Tiến hành kiểm tra trên chuột nhắt trắng 14-16g, chuột được chia làm 2 nhóm: nhóm tiêm mẫu thử và nhóm chuột chứng (10 chuột /mẫu thử và 10 chuột/mẫu chứng). Chuột được cân trọng lượng (Po) trước khi tiêm. Mẫu thử được đo độ đục và pha loãng để có 8x10⁹ vi khuẩn/ml. Tiêm phúc mạc 0,5ml/chuột.

Theo dõi chuột sau khi tiêm:

-

- Chuột  sau khi tiêm được chăm sóc và theo dõi trọng lượng trong 7 ngày.

- Cân chuột vào các ngày thứ nhất, thứ ba, thứ năm và thứ bảy sau khi tiêm. Ghi kết quả vào phiếu theo dõi..

Tính kết quả:

- Giá trị của thử nghiệm:

Thử nghiệm chỉ có giá trị khi chuột ở nhóm chứng không chết, khoẻ mạnh, tăng trọng bình thường.

- Công thức tính :

                                      % tăng trọng

Trong đó: P(t,  k): trọng  lượng  chênh  lệch  giữa  ngày thứ 3 hoặc ngày thứ 7 với ngày tiêm của                                                                                                                                                        thứ 7 với ngày tiêm của nhóm thử / nhóm chứng.

Po, P3, P7 : trọng lượng trung bình của nhóm chuột vào ngày tiêm 0, ngày thứ 3, ngày thứ 7.

N : số chuột trong từng nhóm.

Tiêu chuẩn chấp thuận:

- Tiêu chuẩn: Tỷ lệ chuột chết 0%;, trọng lượng trung bình ngày thứ 3 ít nhất bằng ngày tiêm;, trọng lượng trung bình ngày thứ 7 ít nhất đạt 60% so với nhóm chứng.

 

Kiểm định vacxinvắc xin  thành phẩm

Cảm quan:

Mẫu kiểm định của mỗi loạt thành phẩm sẽ phải được kiểm tra bằng mắt thường. Nếu kết quả kiểm tra cho thấy có sự bất thường, không theo đúng yêu cầu cần phải hủy bỏ.

*Thử nghiệm  Vvô khuẩn:

VacxinVắc xin  tả uống phải đạt yêu cầu về vô khuẩn.

Phương pháp tiến hành: Phụ lục … (115.7).

* pH:

Nằm trong khoảng từ 6,8 - 7,4.

Phương pháp tiến hành: Phụ lục …(115.33).

*Hàm lượng Protein toàn phần: Không quá 2 g%.

Phương pháp tiến hành: Phụ lục … (15.18).

* Hàm lượng Formaldehyde:

Hàm lượng Hàm lượng formaldehyde tồn dư không quá 0,02 g%.

Phương pháp tiến hành: Phụ lục … ( 15.25).

* Hàm lượng Thimerosal: Không quá 0,02 g% .

Phương pháp tiến hành: Phụ lục … (15.29).

* Thử nghiệm Aan toàn không đặc hiệu

Thử nghiệm tăng trọng trên chuột nhắt trắng Swiss.

Phương pháp tiến hành: Như kiểm định vacxinvắc xin  bán thành phẩm cuối cùng.

Tiêu chuẩn: chuột chết 0%, trọng lượng trung bình ngày thứ 3 ít nhất bằng ngày tiêm, trọng lượng trung bình ngày thứ 7 ít nhất đạt 60% so với nhóm chứng.

*Thử nghiệm  Ccông hiệu:

Thử nghiệm công hiệu được tiến hành trên thỏ không có kháng thể kháng vi khuẩn tả. Mỗi loạt vacxinvắc xin  tả uống cần 3 thỏ có trọng lượng từ 2-2,2 kg.

VacxinVắc xin  tả uống được pha loãng trong dung dịch PBS 0,01M (pH=7,2) hoặc nước muối sinh lý để đạt 4 tỉ vi khuẩn/ml. Gây miễn dịch cho thỏ bằng cách tiêm vào bắp chân sau, mỗi thỏ 1 ml vacxinvắc xin  đã được pha loãng như trên. Mỗi thỏ được tiêm ba mũi, mỗi mũi cách nhau 1 tuần (vào các ngày thứ 0, 7 và 14). Sau tiêm, thỏ được chăm sóc, theo dõi hàng ngày.

Đến ngày thứ 24, thỏ được lấy máu và tách huyết thanh trong điều kiện vô khuẩn. Tiến hành phản ứng ngưng kết trong ống nghiệm giữa huyết thanh thỏ và các vi khuẩn tả mẫu. Huyết thanh của mỗi thỏ được pha loãng bậc 2 thành các độ pha: 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 và 1/640.

Kháng nguyên vi khuẩn tả gồm 3 chủng 569B, Cairo 50 và Phil. 6973El Tor được đo đậm độ vi khuẩn và pha loãng để có 1 tỉ vi khuẩn/ml.

Tiến hành phản ứng ngưng kết từng loại kháng nguyên đặc hiệu với huyết thanh thỏ ở các bậc pha loãng khác nhau. Đọc kết quả sau 48 giờ.

Kết quả: Hiệu giá huyết thanh được tính ở độ pha loãng thấp nhất vẫn có hiện tượng ngưng kết.

Tiêu chuẩn: công hiệu của vacxinvắc xin  tả uống đạt yêu cầu khi hiệu giá trung bình từng loại kháng nguyên ≥≤ 1/80.

 

Đóng gói và bảo quản

VacxinVắc xin  tả uống bất hoạt được đóng trong lọ thủy tinh trung tính. VacxinVắc xin  phải được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 - 8^oC8^OC, không được để đông băng.

 

Hạn dùng

Hạn dùng của vắc xin được nghiên cứu dựa trên tính ổn định của công hiệu trên ít nhất 3 loạt liên tiếp (được sản xuất từ 3 loạt bán thành phẩm riêng biệt). Các loạt vắc xin dùng trong thời gian nghiên cứu phải được bảo quản ở điều kiện như trên tờ hướng dẫn sử dụng.

VacxinVắc xin  tả uống bất hoạt có hạn dùng là không quá 2 năm kể từ sau ngày sản xuất.

 

Nhãn, hộp

Những thông tin  đối với nhãn, hộp, tờ hướng dẫn sử dụng phải đáp ứng những yêu cầu quy định trong Thông tư số 04/2008/TT-BYT, ngày 12/5/2008 của Bộ Y tế về Hướng dẫn ghi nhãn thuốc.

Cần ghi rõ những thông tin cần có đối với nhãn (lọ vắc xin, hộp vắc xin, tờ hướng dẫn sử dụng) Ttheo thông tư số 14/2000/TT-BYT ngày 22-6-2000 và của Cục Y tế dự phòng, thông tư số 14/2001/TT-BYT ngày 26-6-2001 của Bộ Y tếCục quản lý dược.

 

Chỉ định, Lliều dùng

VacxinVắc xin  tả uống bất hoạt chỉ dùng đường uống.

Liều dùng: 1,5 ml/người.

Lịch dùng: 2 liều cách nhau 14 ngày.