VACXIN THƯƠNG HÀN VI POLYSACCHARID

Vi polysacarid typhoid vaccine

 

 

Định nghĩa

Vacxin thương hàn Vi polysaccharid là một chế phẩm tinh chế từ của vỏ Vi polysaccharid của vi khuẩn. Polysaccharid này được điều chế từ chủng Salmonella typhi Ty2 hoặc một chủng thích hợp khác có khả năng sản sinh ra  Vi polysaccharid.

Vỏ Vi polysaccharid có chứa một phần 3-O-acetylated các đơn vị lặp lại của acid 2-acetylamino-2-deoxy-D-galactopyranuronic với những cầu nối a-(1® 4).

Sản xuất

* Chủng sản xuất:

Chủng Salmonella typhi dùng để sản xuất vacxin Vi polysaccharid phải được cơ quan điều hành quốc gia chấp thuận. Chủng này phải cho thấy có khả năng sản sinh ra Vi polysaccharid với sản lượng ổn định, đủ đáp ứng miễn dịch và an toàn cho người.

Phương pháp sản xuất phải được thẩm định và chứng minh rằng sản phẩm nếu được kiểm tra sẽ hoàn toàn đạt các yêu cầu về an toàn không đặc hiệu đối với huyết thanh miễn dịch và vacxin cho người sử dụng.

Chủng S. typhi Ty2 đã cho thấy là một chủng thích hợp để sản xuất vacxin thương hàn Vi polysaccharid.

Chỉ có chủng đạt các đặc tính như sau mới được dùng để sản xuất vacxin: nNhuộm soi sau nuôi cấy phải có hình dạng đặc trưng của S. typhi; trong môi trường nuôi cấy, có lên men đường glucose:nhưng không sinh hơi; oxidase âm tính; huyền dịch vi khuẩn ngưng kết đặc hiệu với huyết thanh kháng Vi thích hợp hoặc khuẩn lạc có quầng sáng xung quanh, trên môi trường thạch đĩa có chứa kháng huyết thanh đặc hiệu.

* Sản xuất chủng gốc và chủng làm việcsản xuất:

Chủng gốc sẽ phải được nhận dạng bằng hồ sơ lịch sử chủng, bao gồm cả nguồn gốc chủng, và các đặc tính sinh hoá, huyết thanh học. Các nuôi cấy từ chủng làm việcsản xuất sẽ phải có cùng đặc tính như nuôi cấy từ chủng gốc. Chủng sản xuất phải đạt các tiêu chuẩn của phần 2.2như chủng gốc.

Nuôi cấy và gặt

Sự phát triển của chủng S. typhi phải cho thấy có tính ổn định bằng cách giám sát tỷ lệ mọc của vi khuẩn, pH của nuôi cấy và sản lượng của Vi polysaccharid. Thông thường nuôi cấy chủng ở 35^oC đến 37^oC. Chủng làm việc có thể nuôi cấy trên môi trường đặc, ủ 12-18 giờ ở 35^oC đến 37^oC sau đó cấy chuyển sang môi trường lỏng (là canh khuẩn để cấy vào môi trường nuôi cấy cuối cùng). Môi trường nuôi cấy cuối cùng là môi trường bán tổng hợp, không chứa chất đã được kết tủa bởi cetrimonium bromide và không chứa các sản phẩm từ máu hoặc các polysaccharid có khối lượng phân tử cao, và ít nhất phải chứng minh rằng chúng đã được loại bỏ sau khi tinh chế.

Sự thuần khiết của vi khuẩn sau khi nuôi cấy phải được khẳng định bằng kiểm tra tiêu bản nhuộm soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại ít nhất 10.000 lần) và bằng nuôi cấy trong môi trường đặc thích hợp. Canh khuẩn nuôi cấy được bất hoạt vào thời điểm bắt đầu pha ổn định bằng cách thêm formaldehyd. Các tế bào vi khuẩn phải được loại bỏ bằng cách ly tâm, polysaccharid được tủa từ môi trường nuôi cấy bằng cách thêm hexadecyltrimethylammonium bromid (cetrimonium bromid). Tủa polysaccharid được gặt và bảo quản ở -20^oC trước khi tinh chế.

Tinh chế Vi polysaccharid

Polysaccharid được tinh chế bằng cách tủa với phức hợp cetrimonium bromid, dùng quy trình thích hợp để loại bỏ acid nucleic, các protein và lipopolysaccharid. Polysacchcarid sẽ được tủa với muối canxi trong sự có mặt của ethanol và làm khô ở 2^oC đến 8^oC. Bột thu được chính là Vi polysaccharid tinh chế. Độ ẩm tồn dư phải được kiểm tra theo phương pháp phân tích trọng lượng và dùng để tính kết quả của các thử nghiệm hoá học cho thấy thấp hơn so với mẫu chuẩn. (khó hiểu)

 

Chỉ Vi polysaccharid tinh chế đạt các tiêu chuẩn dưới đây mới được sử dụng để pha chế vacxin bán thành phẩm cuối cùng:

- Protein: không quá 10 mg/g polysaccharid.

- Acid nucleic: không quá 20 mg/g polysaccharid.

- O-Acetyl: không thấp hơn 2 mmol/g polysaccharid.

- Kích thước phân tử: kiểm tra bằng sắc ký cột, dùng cột dài 0,9 m và đường kính lòng ống 16 mm, chuẩn cột với dung dịch NaCl 0,2 mol/kg ?, pH 7,0-7,5. Dùng 5 mg polysaccharid cho vào 1 ml dung dịch NaCl và rót vào cột, thoát với tốc độ 20 ml/h. Thu thập mẫu khoảng 2,5 ml. Kiểm tra điểm đáp ứng với K_D = 0,25 và làm 2 thể tích mẫu thoát ra trước và sau điểm đáp ứng. Tiến hành xác định hàm lượng O-Acetyl của cả 2 mẫu trên. Không được thấp hơn 50% polysaccharid được tìm thấy ở mẫu thoát ra trước khi K_D = 0,25.

- Nhận dạng: dùng phương pháp hoá miễn dịch thích hợp.

- Endototxin của vi khuẩn: không được quá 150 ^IU/µg  polysaccharid.

Vacxin bán thành phẩm cuối cùng

Bán thành phẩm cuối cùng được điều chế từ một hoặc nhiều loạt đơn Vi polysaccharid tinh chế. Nếu sử dụng bán thành phẩm này để đóng lọ đa liều thì phải cho thêm chất bảo quản chống nhiễm trùng và được hoà tan trước, trong một dung môi thích hợp, sao cho sản phẩm cuối cùng chứa 25 µg polysaccharid /1 liều tiêm cho người. Hàm lượng chất bảo quản trong bán thành phẩm cuối cùng phải không được gây biến tính Vi polysaccharid và các thành phần khác của vacxin. Vacxin  bán thành phẩm được pha chế (trong điều kiện vô trùng) trong dung dịch không có chứa chất gây sốt và được lọc vô trùng qua màng lọc. 

Bán thành phẩm cuối cùng chỉ được phép pha chế thành thành phẩm khi đạt các yêu cầu sau:

* Vô khuẩn: Phụ lục 15.7

* Kiểm tra hàm lượng  chất bảo quản:  Phụ lục 15.29

* Hàm lượng Vi polysaccharid: dùng thử nghiệm hoá miễn dịch định lượng đã được cơ quan kiểm định quốc gia chấp thuận để xác định hàm lượng Vi polysaccharid của mẫu bán thành phẩm cuối cùng. Phụ lục 15.37

* Nhận dạng: Dùng thử nghiệm huyết thanh học, dựa vào sự kết tủa miễn dịch.

Đóng ống và đóng gói:

Quá trình đóng ống và đóng gói phải tuân thủ GMP code cho vacxin và sinh phẩm của Việt Nam.

Kiểm định vacxin thành phẩm

Các thử nghiệm dưới đây phải được tiến hành với mỗi loạt vacxin thành phẩm.

* Cảm quan:

Vacxin dạng lỏng, trong suốt, không màu, không có vật thể lạ mắt thường có thể nhìn thấy và không có những dấu hiệu bất thường khác như: lỏng nút, nắp, hàn không đạt yêu cầu...

* Nhận dạng:Thử nghiệm nhận dạng được tiến hành bằng phương pháp hoá miễn dịch thích hợp.

* Xác định thành phầnhàm lượng Vi polysaccharid:

Lấy mẫu ngẫu nhiên, ít nhất 3 lọ (hoặc ống), xác định hàm lượng Vi polysaccharid bằng thử nghiệm hoá miễn dịch định lượng, so sánh với mẫu chuẩn polysaccharid. Phương pháp kiểm định phải được sự chấp thuận của cơ quan kiểm định quốc gia. Phụ lục 15.37

Tiêu chuẩn chấp thuận: 25 µg Vi polysaccharid ± 30%  cho một liều đơn cho người.

* Vô khuẩn: Phụ lục 15.7

* Chất gây sốt:

Mỗi loạt vacxin thành phẩm phải được kiểm tra chất gây sốt bằng cách tiêm vacxin thương hàn Vi polysacarid (1ml/kg thể trọng thỏ; trong đó dung dịch vacxin có chứa 25 µg Vi polysaccharid/ml) vào tĩnh mạch tai thỏ. Phụ lục 15.12.

* An toàn không đặc hiệu: ??? An toàn chung:

Loạt vacxin thành phẩm thương hàn Vi polysaccharid đạt yêu cầu về an toàn không đặc hiệu khi tất cả các chuột thử nghiệm đều sống sót và không bị giảm cân trong ít nhất 7 ngày theo dõi. Phụ lục 15.11

* Chất bảo quản:

Nếu chất bảo quản được thêm vào bán thành phẩm, thì hàm lượng chất bảo quản phải được kiểm tra ở mỗi loạt thành phẩm. Phương pháp kiểm tra phải được cơ quan kiểm định quốc gia chấp thuận. Phụ lục 15.29

Tiêu chuẩn chấp thuận: Hàm lượng chất bảo quản phải không được thấp hơn lượng tối thiểu cho thấy có tác dụng bảo quản và không được lớn hơn 115% hàm lượng chất bảo quản ghi trên nhãn. Nếu phenol được sử dụng để điều chế vacxin thì không được nhiều hơn 2,5 g/l. Phụ lục 15.28

*Độ ẩm tồn dư (Nếu vacxin ở dạng đông khô):

Phương pháp áp dụng phải được cơ quan kiểm định quốc gia chấp thuận. Thông thường sử dụng phương pháp Kalh Fisher để xác định độ ẩm tồn dư trong vacxin. Lấy mẫu ngẫu nhiên để kiểm định theo tỷ lệ 1/1000 lọ, tuy nhiên tối đa là 10 lọ và cũng không được ít hơn 5 lọ. Phụ lục 15.35

Tiêu chuẩn chấp thuận: Độ ẩm tồn dư trung bình giữa các lọ không được lớn hơn 2,5%, không được lọ nào có độ ẩm tồn dư 3% hoặc lớn hơn.

* pH: 7,0 ± 0,5. Phụ lục 15.33

*Nghiên cứu tính ổn định:

Nghiên cứu tính ổn định phải được tiến hành để xác định hạn dùng của vacxin thương hàn Vi polysaccharid. Nghiên cứu này có thể dựa trên các thử nghiệm xác định hàm lượng O-Acetyl và kích thước phân tử của ít nhất là 3 loạt vacxin thành phẩm (các loạt vacxin thành phẩm này phải được sản xuất từ những bán thành phẩm Vi polysaccharid tinh chế riêng biệt). Các loạt vacxin dùng trong thời gian nghiên cứu phải được bảo quản ở điều kiện như ghi trên tờ hướng dẫn dành cho người sử dụng.

Tiêu chuẩn chấp thuận: Kích thước phân tử của mỗi loạt vacxin thành phẩm phải đạt ít nhất 50% Vi polysacarid từ cột thoát ra trước khi K_D đạt tới 0,25. Thử nghiệm về tính ổn định phải được cơ quan kiểm định quốc gia chấp thuận.

Đóng gói, bảo quản, hạn dùng

*Đóng gói và dán nhãn:

Việc đóng gói, dán nhãn phải tuân thủ theo GMP code đối với vacxin và sinh phẩm của Việt Nam.

Các tuyên bố về hạn dùng và nhiệt độ bảo quản sẽ phải dựa trên những nghiên cứu về tính ổn định của vacxin và phải đệ trình lên cơ quan kiểm định quốc gia về vacxin và sinh phẩm. Hạn sử dụng vacxin in trên nhãn phải dựa vào số liệu thử nghiệm nhưng dù kết quả đó như thế nào thì hạn dùng của vacxin thương hàn Vi polysaccharid cũng không được quá 3 năm kể từ ngày đóng ống thành phẩm.

Nhãn trên hộp giấy hoặc tờ hướng dẫn sử dụng phải chứa các thông tin như sau:

- Hàm lượng Vi polysaccharid trong mỗi liều đơn cho người.

- Nếu ở dạng lỏng phải ghi rõ thể tích.

Trên tờ hướng dẫn sử dụng đi kèm với ống/lọ vacxin phải chứa các thông tin:

- Ghi rõ rằng sản phẩm đông khô (nếu dùng vacxin đông khô) phải được hoàn nguyên; với vacxin dạng lỏng đa liều đã được mở chỉ được sử dụng trong ngày làm việctrước 6 giờ kể từ lúc vắc xin được mở để tránh nhiễm trùng.

- Ghi rõ nhiệt độ thích hợp cần thiết để bảo quản.

*Bảo quản:

Nhiệt độ bảo quản thích hợp cho vacxin thương hàn Vi polysaccharid  là 2-8^oC.

Hạn sử dụng:

Không được quá 3 năm kể từ ngày đóng ống thành phẩm.     

 

 

 

 

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

1.      WHO requirement TRS No. 814, 1991. Requirements for Vi polysaccharide typhoid vaccine.

2.      WHO requirement TRS No. 840, 1996. Annex 1 Requirements for Biological Substances No.48).

3.      Dược điển Anh 2003.

4.1.       4.   Dược điển Châu Âu, monograph 1160.

1.