VẮC XIN BẠCH
HẦU - UỐN VÁN – HO GÀ HẤP PHỤ (DTP)
Vaccinum diphtheriae tetani et pertussis adsorbatum
Định
nghĩa
Vắc xin bạch hầu-uốn
ván-ho gà là một hỗn hợp gồm các giải độc
tố bạch hầu, uốn ván tinh chế hấp phụ
và vắc xin ho gà toàn tế bào hoặc vắc xin ho gà vô bào.
Sản
xuất
Sản
xuất giải độc tố bạch hầu
Vắc xin bạch hầu
được sản xuất dựa vào hệ thống
chủng gốc. Chủng Corynebacterium diphtheriae dùng cho
sản xuất phải tuân thủ theo quy định
về hệ thống chủng gốc và được
nuôi cấy trên môi truờng lỏng thích hợp. Cuối
giai đoạn nuôi cấy, cần kiểm tra tính thuần
khiết để loại bỏ những loạt nuôi
cấy đơn bị nhiễm tạp. Xác định hàm
lượng độc tố bạch hầu (Lf/ml)
bằng phản ứng lên bông. Các mẻ gặt đơn
có thể hỗn hợp lại để giải
độc bằng Formaldehyd và tinh chế theo phương
pháp thích hợp.
Giải độc tố
bạch hầu tinh chế được kiểm tra vô
khuẩn, tính độc đặc hiệu, tính hồi
độc, độ tinh sạch của kháng nguyên trước
khi pha chế vắc xin bán thành phẩm cuối cùng.
Kiểm
tra tính vô khuẩn
Tiến hành thử nghiệm
vô khuẩn trên môi trường canh thang Thioglycolat và Soybean
Casein với mẫu giải độc tố bạch
hầu tinh chế: 10 ml giải độc tố bạch
hầu cho mỗi môi trường.
Cách tiến hành và tiêu chuẩn
chấp thuận: Phụ lục 15.7.
Kiểm
tra tính độc đặc hiệu
Tiêm dưới da ít nhất
500 Lf của giải độc tố bạch hầu tinh
chế chứa trong thể tích 1 ml vào mỗi trong số 5
chuột lang khoẻ mạnh, trọng lượng 250 – 350
g/con chưa sử dụng vào bất cứ mục đích
gì trước đó. Theo dõi chuột trong vòng 42 ngày sau tiêm,
nếu thấy bất kỳ triệu chứng nào hay
bị chết do độc tố bạch hầu thì lô
giải độc tố bạch hầu tinh chế này
không đạt về tính an toàn đặc hiệu. Nếu
có hơn một chuột lang thử nghiệm bị
chết trong thời gian theo dõi vì bất kỳ nguyên nhân nào
thì phải nhắc lại thử nghiệm. Nếu có
hơn một chuột lang thử nghiệm bị chết
trong lần thử nghiệm thứ hai thì lô giải
độc tố bạch hầu tinh chế này cũng không
đạt về tính an toàn đặc hiệu.
Kiểm
tra tính hồi độc
Sử dụng dung dịch
đệm giống như dùng để pha vắc xin thành
phẩm nhưng không có chất hấp phụ để pha
loãng giải độc tố bạch hầu tinh chế
sao cho có chứa hàm lượng giải độc tố
tương đương như trong vắc xin thành
phẩm (35 Lf/ml); chia thành 2 phần tương đương
nhau và ủ mỗi phần của dung dịch này ở
nhiệt độ khác nhau (5 ± 3OC và 37OC)
trong 6 tuần. Mỗi trong 2 mẫu thử sau khi ủ
được đưa ra kiểm tra tính hồi
độc của độc tố bạch hầu
bằng cách tiêm dưới da cho 5 chuột lang khoẻ
mạnh, trọng lượng 250 – 350 g/con.
Giải độc tố
bạch hầu tinh chế đạt yêu cầu về
thử nghiệm tính hồi độc khi các chuột
thử nghiệm đều khoẻ mạnh, lên cân và không
có chuột nào có dấu hiệu về phản ứng do
độc tố bạch hầu trong 6 tuần theo dõi.
Kiểm
tra độ tinh sạch của kháng nguyên bạch hầu
Giải độc tố
bạch hầu tinh chế phải đạt không ít hơn
1500 Lf/mg Nitrogen protein.
Sản
xuất giải độc tố uốn ván
Vắc xin uốn ván
được sản xuất dựa vào hệ thống
chủng gốc. Chủng Clotridium tetani dùng cho sản
xuất phải tuân thủ theo quy định về hệ
thống chủng gốc và được nuôi cấy trên
môi truờng thích hợp. Cuối giai đoạn nuôi cấy,
cần kiểm tra tính thuần khiết để loại
bỏ những loạt nuôi cấy đơn bị
nhiễm tạp. Xác định hàm lượng độc
tố uốn ván (Lf/ml) bằng phản ứng lên bông. Các
mẻ gặt đơn có thể hỗn hợp lại
để giải độc bằng Formaldehyd và nhiệt
độ; tinh chế theo phương pháp thích hợp.
Số lượng Lf trong
vắc xin uốn ván bán thành phẩm tùy thuộc vào công
thức gốc của từng nhà sản xuất nhưng
không được quá 25 Lf trong một liều đơn
cho người nếu sử dụng nhiều hơn
một liều cho phác đồ tiêm miễn dịch cơ
bản.
Giải độc tố
uốn ván tinh chế được kiểm tra vô
khuẩn, tính độc đặc hiệu, tính hồi
độc, độ tinh sạch của kháng nguyên
trước khi pha chế vắc xin bán thành phẩm
cuối cùng.
Kiểm
tra tính vô khuẩn
Tiến hành thử nghiệm
vô khuẩn trên môi trường canh thang Thioglycolat và Soybean
Casein với mẫu giải độc tố uốn ván
tinh chế: 10 ml giải độc tố uốn ván cho
mỗi môi trường.
Cách tiến hành và tiêu chuẩn
chấp thuận: Phụ lục 15.7.
Kiểm
tra tính độc đặc hiệu
Tiêm dưới da ít nhất
500 Lf của giải độc tố uốn ván tinh
chế chứa trong thể tích 1 ml vào mỗi trong số 5
chuột lang khoẻ mạnh, trọng lượng 250 – 350
g/con chưa điều trị bất cứ gì
trước đó. Theo dõi chuột trong vòng 21 ngày sau tiêm,
nếu thấy bất kỳ triệu chứng nào hay
bị chết do độc tố uốn ván thì lô giải
độc tố uốn ván tinh chế này không đạt
về tính an toàn đặc hiệu. Nếu có hơn
một chuột lang thử nghiệm bị chết trong
thời gian theo dõi vì bất kỳ nguyên nhân nào thì phải
nhắc lại thử nghiệm. Nếu có hơn một
chuột lang thử nghiệm bị chết trong lần
thử nghiệm thứ hai thì lô giải độc tố
uốn ván tinh chế này cũng không đạt về tính
an toàn đặc hiệu.
Kiểm
tra tính hồi độc
Sử dụng dung dịch
đệm dùng để pha vắc xin thành phẩm nhưng
không có chất hấp phụ để pha loãng giải
độc tố uốn ván tinh chế sao cho có chứa hàm
lượng giải độc tố tương
đương như trong vắc xin thành phẩm (12,5
Lf/ml); chia thành 2 phần tương đương nhau và
ủ mỗi phần của dung dịch này ở nhiệt
độ khác nhau (5 ± 3OC và 37OC) trong 6
tuần. Mỗi trong 2 mẫu thử sau khi ủ
được đưa ra kiểm tra tính hồi
độc của độc tố uốn ván bằng cách
tiêm dưới da cho 5 chuột lang khoẻ mạnh,
trọng lượng 250 – 350 g/con.
Giải độc tố
uốn ván tinh chế đạt yêu cầu về thử
nghiệm tính hồi độc khi các chuột thử
nghiệm đều khoẻ mạnh, lên cân và không có
chuột nào có dấu hiệu về phản ứng do
độc tố uốn ván trong 3 tuần theo dõi.
Kiểm
tra độ tinh sạch của kháng nguyên uốn ván
Giải độc tố
uốn ván tinh chế phải đạt không ít hơn 1000
Lf/mg Nitrogen protein.
Sản
xuất nước cốt ho gà bất hoạt:
Nước cốt ho gà
được sản xuất dựa vào hệ thống
chủng gốc. Chủng Bordertella pertussis dùng cho
sản xuất vắc xin ho gà phải tuân thủ theo quy
định về hệ thống chủng gốc và
được nuôi cấy trên môi truờng thích hợp.
Việc lựa chọn chủng nuôi cấy, môi
trường và phương pháp nuôi cấy thích hợp
nhằm tạo ra vắc xin ho gà thành phẩm có
được 3 ngưng kết nguyên 1; 2; 3. Từng chủng được nuôi
cấy 24 - 72 giờ trong môi trường lỏng hoặc
đặc. Không được dùng máu người hoặc
các sản phẩm từ máu người trong bất kỳ
môi trường nuôi cấy chủng ho gà nào để
sản xuất vắc xin ho gà. Môi trường dùng trong giai
đoạn nuôi cấy ho gà cuối cùng cũng không
được phép có máu hoặc sản phẩm của máu.
Sau khi nuôi cấy, gặt và
rửa sinh khối vi khuẩn ho gà để loại
bỏ các chất còn tồn dư của môi trường
nuôi cấy; pha thành hỗn dịch ho gà với nước
muối sinh lý vô khuẩn thành hỗn dịch
nước cốt ho gà cô đặc.
Kiểm tra
tính thuần khiết của các mẻ gặt đơn
Lấy mẫu
từ các mẻ gặt đơn để kiểm tra tính
thuần khiết bằng phương pháp nhuộm soi kính
hiển vi hoặc cấy vào môi trường nuôi cấy thích
hợp. Các mẻ gặt đơn sẽ không
được phép sử dụng vào việc pha chế bán
thành phẩm khi phát hiện có nhiễm bất kỳ
một loại gì khác vào sản phẩm.
Kiểm tra độ đục
Dùng bộ so
độ đục chuẩn quốc tế hoặc đo
OD (λ = 560 nm) của hỗn dịch nước cốt
ho gà cô đặc (không được muộn hơn hai tuần
sau khi gặt và trước khi huyền dịch vi khuẩn
được đưa vào bất kỳ quy trình pha
chế nào tiếp theo) để xác định đậm
độ của nước cốt ho gà cô đặc.
Đậm độ nước cốt ho gà
được sử dụng làm cơ sở để
tính toán khi pha chế vắc xin bán thành phẩm cuối cùng.
Thành phần ho
gà trong vắc xin DTP hỗn hợp không vượt quá 20
đơn vị độ đục quốc tế (IOU)
trong một liều đơn vắc xin cho người.
Tỷ lệ thành phần các chủng B. pertussis không
được thay đổi khi hỗn hợp vắc xin,
phải đăng ký rõ trong hồ sơ và được
sự chấp thuận của cơ quan kiểm
định quốc gia.
Kiểm tra
độ sóng sót
Hỗn
dịch vi khuẩn ho gà được giết chết và
giải độc bằng phương pháp được
sự chấp thuận của cơ quan kiểm
định quốc gia. Nếu các hóa chất
được sử dụng để giết chết và
giải độc vi khuẩn ho gà cũng phải
được sự chấp thuận bởi cơ quan
kiểm định quốc gia. Hỗn dịch vi khuẩn
ho gà được giết chết bằng nhiệt
độ trong khoảng thời gian thích hợp và
được kiểm tra sự sống sót của các vi
khuẩn này trên môi trường Border - Gengou. Sau khi bất
hoạt, nước cốt ho gà được bảo
quản ở nhiệt
độ 5 ± 3OC trong một khoảng thời gian
cần thiết để giảm bớt tính độc.
Mỗi
loạt nước cốt ho gà đơn sẽ không
được dùng để pha chế vắc xin bán thành
phẩm khi không đạt các tiêu chuẩn về vô
khuẩn, khả năng bất hoạt hoàn toàn (kiểm tra
độ sống sót), nhận dạng, khả năng phát
triển, ngưng kết như chủng gốc B. pertussis.
Phương pháp sản xuất
phải được thẩm định để chứng
minh rằng sản phẩm khi kiểm định sẽ tuân
thủ và đạt được các tiêu chuẩn như
mô tả dưới đây.
Kiểm
định vắc xin bán thành phẩm
Vắc xin bán thành phẩm được
pha chế và hỗn hợp bởi một lượng thích
hợp của giải độc tố bạch hầu và
giải độc tố uốn ván đã được hấp
phụ bởi hydrat aluminium phosphat hoặc aluminium hydroxid và
hỗn thêm một lượng thích hợp của huyền
dịch B. pertussis đã được
bất hoạt; kết quả của sự hỗn hợp
này khi tiêm vào cơ thể phải phù hợp về mặt
sinh lý với máu. Hàm lượng B.
pertussis của vắc xin bán thành phẩm phải không được
vượt quá 20 IOU cho một liều đơn cho người.
Nếu sử dụng 2 hoặc nhiều hơn số chủng
B. pertussis thì khi pha vắc
xin bán thành phẩm phải tính toán sao cho tổng số đơn
vị độ đục của các chủng ho gà đưa
vào phải không thay đổi giữa các loạt vắc
xin và không vượt quá 20 IOU cho một liều đơn
cho người. Hàm lượng chất bảo quản
trong vắc xin DTP hấp phụ phải không ảnh
hưởng đến tính sinh miễn dịch của
giải độc tố uốn ván, bạch hầu,
vắc xin ho gà và không gây ra những phản ứng có
hại cho người sử dụng.
Chỉ vắc xin bán thành phẩm
cuối cùng nào tuân thủ và đạt các yêu cầu dưới
đây mới được sử dụng để sản
xuất thành phẩm.
Chất
bảo quản kháng khuẩn
Xác định hàm lượng
chất bảo quản kháng khuẩn trong vắc xin bán thành
phẩm cuối cùng bằng phương pháp thích hợp. Hàm
lượng chất bảo quản không được ít
hơn 85% và không được nhiều hơn 115% của
lượng chất bảo quản tiêu chuẩn cho vào
vắc xin. Phụ lục 15.29.
Tính
vô khuẩn
Tiến hành thử nghiệm vô
khuẩn (thông thường kiểm tra trên môi trường
thioglycolate và soybean casein) dùng 10 ml vắc xin để kiểm
tra trên mỗi môi trường. Phụ lục 15.7.
Công
hiệu: Tiến hành
các thử nghiệm kiểm tra công hiệu như trong các
phụ lục về công hiệu bạch hầu, uốn
ván và ho gà.
Công
hiệu bạch hầu
Công hiệu của giải độc
tố hoặc thành phần bạch hầu trong vắc xin
DTP được xác định bằng 1 trong 2
phương pháp: trung hoà
độc tố trên chuột lang hoặc chuẩn
độ huyết thanh chuột nhắt trên tế bào Vero. Phụ
lục 15.23.
Tiêu chuẩn chấp thuận: Vắc
xin đạt yêu cầu về công hiệu bạch hầu
nếu có không ít hơn 30 IU kháng độc tố bạch
hầu trong một liều đơn vắc xin cho
người với điều kiện 95% khoảng
tin cậy của công hiệu tìm được nằm
trong giới hạn từ 50 % đến 200%. Nếu
khoảng tin cậy 95% lớn
hơn 50 – 200% thì giới hạn cận dưới
của khoảng tin cậy
của công hiệu phải ³ 30 IU trong 1
liều vắc xin cho người.
Công hiệu
uốn ván
Công hiệu của giải
độc tố uốn ván hoặc thành phần uốn ván
trong vắc xin DTP được xác định bằng
phương pháp so sánh liều hữu hiệu 50 % (ED50)
của vắc xin chuẩn và vắc xin thử. Kết
quả được tính theo phương pháp probit analysis.
Phụ lục 15.22.
Tiêu chuẩn chấp thuận: Tiêu
chuẩn công hiệu của thành phần uốn ván trong vắc
xin DTP là 60 IU trong 1 liều đơn cho người
với điều kiện 95 % khoảng tin cậy của
thử nghiệm nằm trong khoảng 50% – 200%. Nếu
khoảng tin cậy 95% lớn hơn 50 – 200 %, thì giới
hạn cận dưới của khoảng tin cậy
của công hiệu phải lớn
hơn 60 IU.
Công hiệu ho gà
Công hiệu của vắc xin
ho gà trong vắc xin DTP được xác định
bằng cách so sánh liều hữu hiệu 50 % ( ED50) của vắc
xin mẫu chuẩn so với vắc xin mẫu thử.
Kết quả được tính bằng phương pháp
probit analysis (phần mềm WHO program). Phụ lục 15.24.
Tiêu chuẩn chấp thuận: Tiêu chuẩn công hiệu của thành phần ho gà trong vắc xin DTP là không ít hơn 4 IU trong 1 liều đơn vắc xin cho người và giới hạn dưới của 95 % khoảng tin cậy của công hiệu tìm được không ít hơn 2 IU trong 1 liều đơn vắc xin cho người.
Tính
độc đặc hiệu
Tính độc đặc hiệu của vắc xin
bạch hầu – uốn ván – ho gà toàn tế bào
được kiểm tra trên mẫu bán thành phẩm
cuối cùng hay vắc xin thành phẩm khi cần thiết. Phụ
lục 15.4.
Đối với thành phần bạch hầu và
uốn ván :
Chọn 5 chuột lang, có trọng lượng 250g –350 g
tiêm dưới da một lượng vắc xin
tương đương với ít nhất 5 liều
đơn cho người. Theo dõi chuột hàng ngày. Vắc
xin đạt yêu cầu nếu không có chuột lang nào
chỉ ra dấu hiệu liệt uốn ván hoặc
triệu chứng nhiễm độc bạch hầu và ít
nhất 80 % chuột sống trong thời gian 6 tuần. Nếu
có chuột chết phải mổ để kiểm tra
phủ tạng về dấu hiệu nhiễm độc
bạch hầu (tuyến
thượng thận đỏ).
Đối với thành
phần ho gà:
Dùng ít nhất 20 chuột nhắt trắng, trọng
lượng 14 –16 g, cùng giới (nếu có cả 2 giới
cần phân chia đều trong các nhóm) cho mỗi mẫu vắc
xin thử và nhóm chứng. Mỗi chuột được
tiêm vào ổ bụng 0,5 ml dung dịch chứa tối
thiểu nửa liều đơn vắc xin cho
người. Nhóm chứng được tiêm 0,5 ml nước
muối sinh lý (tốt nhất chứa cùng hàm lượng
chất bảo quản như có trong dung dịch tiêm cho nhóm
thí nghiệm). Tổng trọng lượng các nhóm chuột
được xác định vào 72 giờ và 7 ngày sau tiêm. Vắc
xin đạt yêu cầu nếu đạt cả 3 tiêu
chuẩn sau:
- Sau 72
giờ tổng trọng lượng chuột không ít hơn
trước tiêm.
- Sau 7 ngày trọng lượng trung bình mỗi chuột
không ít hơn 60 % so với nhóm chứng.
- Số chuột
chết không quá 5 % tổng số chuột đã
được tiêm.
Kiểm định vắc xin thành phẩm
Nhận
dạng
Thành
phần bạch hầu, uốn ván, ho gà toàn tế bào trong
vắc xin DTwP hấp phụ được tách gel bằng
cách cho thêm citrat natri (C6H507Na32H20 ) với nồng độ 5%
ủ ở 370 C trong 48 giờ. Sau đó ly tâm 2000
vòng/ phút trong 15 phút. Nước nổi được dùng
để nhận dạng thành phần bạch hầu và
uốn ván bằng phản ứng lên bông, cặn ly tâm dùng
để nhận dạng thành phần ho gà có trong vắc
xin bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính
với các huyết thanh kháng ho gà đặc hiệu.
Phụ lục 15.19.
Vô khuẩn: Phụ
lục 15.7.
An toàn chung
Thử nghiệm được tiến
hành trên chuột nhắt trắng và chuột lang khoẻ
mạnh. Tiêm vào ổ bụng cho 5 chuột nhắt
trắng có trọng lượng 17 – 22g/con, mỗi con
một nửa liều tiêm cho người; 2 chuột lang có
trọng lượng 250 –350 g,
mỗi con một liều tiêm cho người nhưng
không quá 1ml/con.
Vắc xin được coi là không có
độc tính bất thường nếu tất cả
các động vật thí nghiệm sống khoẻ mạnh
và lên cân trong thời gian ít nhất 7 ngày thử nghiệm và
không có dấu hiệu nhiễm độc.
Công hiệu: (Tiến hành kiểm tra ở mẫu vắc xin DTP thành
phẩm khi chưa kiểm tra công hiệu trên vắc xin bán
thành phẩm hoặc khi có chỉ định cần
thiết). Phụ lục 15.22; 15.23; 15.24.
Tính chất vật lý,
hoá học
Cảm quan
Kiểm tra hình dạng bên ngoài của
vắc xin bằng mắt thường: Huyền dịch
vắc xin chia thành 2 lớp, phần dung dịch phía trên
trong suốt không màu hoặc vàng nhạt; lớp lắng
cặn dưới đáy lọ có màu trắng xám.
Nhanh chóng tạo huyền dịch đồng nhất sau
khi lắc nhẹ, không lẫn chất lạ.
Tính chất vật lý
Thể
tích vắc xin mỗi lọ: thể tích ghi trên nhãn + 10%.
Tỷ lệ loại bỏ:
- Đối với vắc xin đa liều: £ 3%
- Đối với vắc xin liều đơn: £ 5%
Không
bị đông băng (tiêu chuẩn này chỉ kiểm tra sau
khi bảo quản hay vận chuyển theo dây chuyên lạnh,
không phải tiêu chuẩn xuất xưởng của nhà
sản xuất): Lọ vắc xin mẫu thử phải có
tốc độ lắng cặn chậm hơn nhiều so
với lọ chứng dương và không có sự tạo
hạt hay hình ảnh bông tuyết lơ lửng trong
huyền dịch vắc xin hay kết thành cục sau khi
lắc.
Chất bảo quản
Chất bảo quản được sử dụng trong
vắc xin DTP là thimerosal. Hàm lượng thimerosal cho phép là 0,005 - 0,02 %. Phụ
lục 15.29.
Chất
hấp phụ
Hàm lượng chất
hấp phụ Al+++ được xác định
dựa vào nguyên tắc phản ứng tạo muối Natri
của acid EDTA (Etylendiamin
tetra acetic) với ion nhôm, sau đó chuẩn độ EDTA
thừa bằng dung dịch sulfat đồng 0,01M. Phụ
lục 15.27.
Hàm lượng Al+++
trong vắc xin DTP hấp phụ không được quá 1,25
mg Al+++/ 1 liều tiêm cho người
pH: 6,0 -7,0. Phụ lục 15.33.
Formaldehyde
tồn dư:
Tiêu
chuẩn chấp thuận: £ 0,02%. Phụ
lục 15.25.
Bảo quản và hạn dùng:
Ở
nhiệt độ 2 - 80C vắc xin có thể
giữ công hiệu 2 năm rưỡi.
Nhà
sản xuất phải đưa ra khuyến cáo về
điều kiện bảo quản và vận chuyển
vắc xin DTP hấp phụ để đảm bảo
rằng vắc xin đạt công hiệu theo yêu cầu cho
đến khi hết hạn sử dụng như đã
đăng ký và ghi trên nhãn. Vắc xin DTP hấp phụ
phải được bảo quản sao cho không bị
đông băng.
Hạn
dùng của vắc xin phải được cơ quan
kiểm định quốc gia chấp thuận và cố
định, dựa vào các số liệu nghiên cứu tính
ổn định của vắc xin và không được
quá 2 năm rưỡi tính từ cuối thử nghiệm
kiểm tra công hiệu (tính từ ngày tiêm miễn dịch
trên động vật thí nghiệm).
Nhãn:
Những
thông tin đối với nhãn,
hộp, tờ hướng dẫn sử dụng phải
đáp ứng những yêu cầu quy định trong Thông
tư số 04/2008/TT-BYT, ngày