VACXINVẮC XIN VIÊM GAN B TÁI TỔ HỢP (rDNA)

Vaccinum Hepatitis B (rDNA)

 

 

Định nghĩa

VacxinVắc xin viêm gan B tái tổ hợp (rDNA) được sản xuất từ kháng nguyên bề mặt (HBsAg) - là một thành phần protein của vi rút viêm gan B. Kháng nguyên bề mặt vi rút viêm gan B được sản xuất theo công nghệ tái tổ hợp ADN và thường được hấp phụ với nhôm hydroxydt nhôm hoặc nhôm phosphate nhôm hydrate.

 

Sản xuất

VacxinVắc xin viêm gan B tái tổ hợp  được điều chế bằng cách sử dụng HBsAg tổng hợp ở tế bào nấm men (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha), tế bào trứng chuột  đất vàng (CHO - Chinese hamster ovary) hoặc các dòng tế bào thích hợp khác đã được biến nạp (transformation)  một plasmid có chứa gen mã hoá HBsAg. Kháng nguyên HBsAg được tinh khiết bằng cách làm ly giải tế bào nấm men và được tách ra khỏi các thành phần nấm men nhờ các kỹ thuật sinh hóa lý.

VacxinVắc xin tái tổ hợp có thể chứa sản phẩm của gen S (protein chủ yếu) hoặc phối hợp sản phẩm của gen S và tiền S2 (protein loại trung bình) hoặc phối hợp cả sản phẩm của gen S, tiền S2 và tiền S1 (protein loại lớn).

 

Kiểm định vacxinvắc xin bán thành phẩm

* Hàm lượng protein:

Protein trong mẫu thử được định lượng theo phương pháp Lowry (. Phụ lục 15.34).

*Nhận dạng:

Xác định sự có mặt của HBsAg bằng kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide SDS - PAGE (Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis). Phụ lục 15.38 ?

* Hàm lượng HBsAg:

 

Xác định hàm lượng HBsAg bằng các thử nghiệm hóa miễn dịch phù hợp, như thử nghiệm miễn dịch phóng xạ (RIA), thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn men (ELISA), thấm miễn dịch hoặc khuếch tán phóng xạ đơn. VacxinVắc xin mẫu thử được so sánh với vacxinvắc xin mẫu chuẩn quốc tế hoặc vacxinvắc xin mẫu chuẩn quốc gia.

*Độ tinh khiết của kháng nguyên :

Được xác định bằng phương pháp sử dụng sắc ký lỏng  (Phụ lục 5.3)hiệu năng cao (HPLC - High performance liquid chromatography) hoặc các phương pháp khác phù hợpp khác như SDS -- PAGE (. Phụ lục 15.39)..

Tiêu chuẩn chấp thuận: kKhông nhỏ hơn 95% so với hàm lượng protein toàn phần.

* Hàm lượng Lipid :

Nguyên lý

Dựa trên phản ứng của lipit  với vanillin trong môi trường acid sulfuric và phosphoric tạo thành hợp chất màu. Đo hợp chất màu này ở bước sóng 540 nm, từ đó xác định hàm lượng lipit trong mẫu thử.

Tiến hành

Mẫu thử được điều chỉnh bằng  nước cất  để có nồng độ protein khoảng 200 mcg/ml.

Hút dung dịch olive oil chuẩn 500 mcg/ml vào các ống nghiệm lần lượt 0,1; 0,2 ;  0,3 ;  0.4 ml, thêm nước cất vừa đủ 1 ml. Hút 1 ml mẫu thử vào ống nghiệm, 1 ml nước cất vào mẫu trắng. Thêm 3 ml acid sulfuric 95% vào mỗi ống nghiệm, lắc mạnh bằng máy lắc. Đun cách thủy 100°C trong 10 phút, làm lạnh bằng nước đá trong 5 phút. Thêm 13 ml dung dịch phosphovanillin vào mỗi ống nghiệm, lắc kỹ. Đun cách thủy 37±2^oC trong 30 phút, làm lạnh, để yên ở nhiệt độ phòng 30 phút. Đo quang phổ bước sóng 540 nm, dựng đường chuẩn, từ đó tính ra hàm lượng lipit trong mẫu thử.

Đơn vị tính : mcg/100 mcg protein.

Cách pha các dung dịch

- Dung dịch olive oil chuẩn 5000 mcg/ml: Cân 0,25 g olive oil vào bình định mức 50 ml, thêm ethanol tuyệt đối vừa đủ, lắc kỹ. Bảo quản dung dịch ở 4-7°C, dùng trong 1 tháng. Trước khi dùng, pha loãng 10 lần bằng nước cất.

- Dung dịch vanillin: Hòa tan 6,0 g vanillin trong 6-7 ml ethanol, chuyển vào bình định mức 1 L, thêm nước cất vừa đủ.

- Dung dịch phosphovanillin: Thêm 350 ml dung dịch vanillin và 50 ml nước cất vào bình tam giác 2 L, thêm 600 ml acid phosphoric 85% trong khi đang khuấy từ.

Tiêu chuẩn đánh giáchấp thuận: kKhông lớn hơn 100 mmcg/100 mgmcg protein (. Phụ lục 15.40.)

 

* Hàm lượng Cesi um clorid (CsCl)

 :

Nguyên lý 

Cesium chloride tồn dư trong quá trình tinh khiết HBsAg được xác định bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion.

Mẫu chuẩn : Hút 1ml nước cất vào 3 ống nghiệm, thêm lần lượt 0,2; 0,4 ; 0,6 ml dung dịch cesium chlorid chuẩn. Mẫu thử : Hút 1 ml mẫu đã pha loãng 5 lần bằng nước khử ion vào ống nghiệm, thêm 0,4 ml dung dịch chuẩn. Lọc các dung dịch mẫu chuẩn và mẫu thử qua màng lọc 0,22 mcm.

Tiến hành

Điều kiện vận hành máy sắc ký ion : Cột IonPac Cs-12, detector đo độ dẫn điện 5-10 mcS, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích mẫu thử : 100 mcl, nhiệt độ phòng.

Dựa vào diện tích pic để tính ra hàm lượng cesium chloride trong mẫu thử.

Đơn vị tính: mcg/20 mcg protein.

Cách pha các dung dịch :

- Dung dịch HCl 40 mM (dung dịch rửa giải): Lọc 1,5 L nước khử ion qua màng lọc 0,45 mcm, hút 3,3 ml acid hydrochloric đậm đặc pha trong vừa đủ 1 L nước vừa lọc trên.

- Dung dịch tetrabutyl ammonium hydroxid (TBAOH) (dung dịch tái sinh) : Hút 66,67 ml TBAOH vào ống đong 2 L, thêm nước khử ion vừa đủ 2 L, khuấy đều.

- Dung dịch cesium cloride chuẩn : Cân chính xác 10 mg (a) cesium chloride, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước khử ion vừa đủ, lắc đều. Pha loãng 10 lần dung dịch cesium chloride chuẩn bằng nước khử ion. Nồng độ cesium chloride thực có trong dung dịch (X) được tính bằng công thức:

                       

Trong đó :        132,9: Phân tử lượng của Cs

                        168,4: Phân tử lượng của CsCl

                        10:       Hệ số pha loãng dung dịch chuẩn

1000:   Chuyển từ  mg sang mcg

 

Tiêu chuẩn đánh giáchấp thuận: Không lớn hơn 5 mmcg/20 mgmcg protein . (Phụ lục 15.41)..

* Hàm lượng Tween 20:

Nguyên lý 

Dựa vào phản ứng của polyethoxylate trong thành phần của Tween 20 với ammonium cobaltothiocyanate tạo thành hợp chất màu xanh lơ tan trong dichloromethane.

Tiến hành

Mẫu thử được điều chỉnh bằng  nước cất  để có nồng độ protein khoảng 100 mcg/ml. Hút 1 ml mẫu thử vào ống nghiệm, thêm 5 ml ethanol 95^o, ly tâm 3500 vòng/phút trong 20 phút ở 20^oC. Chuyển nước nổi sang ống nghiệm khác, rửa tủa bằng 1 ml ethanol 95^o, chuyển nốt nước rửa tủa vào ống nghiệm. Đun cách thủy nước nổi thu được ở 80^oC cho đến khi còn lại khoảng 0,5 ml, thêm 1 ml nước cất vào ống nghiệm.

Hút dung dịch Tween 20 chuẩn 1 mg/ml vào các ống nghiệm lần lượt theo thể tích 10, 25, 50, 75, 100 mcl, thêm nước cất vừa đủ 1 ml. Mẫu trắng là 1 ml nước cất. Thêm 2 ml dichloromethane vào mỗi ống nghiệm đựng mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử, thêm tiếp 3 ml ammonium cobaltothiocyanate, lắc kỹ, để yên ở nhiệt độ phòng trong 90 phút. Hút bỏ nước nổi bằng máy hút chân không, đo quang phổ lớp dichloromethane màu xanh lơ phía dưới ở bước sóng 620 nm, dựng đường chuẩn, từ đó tính ra hàm lượng Tween 20 trong mẫu thử.

Đơn vị tính: mcg/100 mcg protein.

Cách pha các dung dịch:

- Dung dịch ammonium cobaltothiocyanate: Hòa tan 6,0 g cobalt nitrate và 40 g ammonium thiocyanate trong nước cất, thêm nước cất vừa đủ 200 ml, lọc qua giấy lọc.

- Dung dịch Tween 20 chuẩn 10 mg/ml : Cân 1g Tween 20 vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất vừa đủ, lắc đều. Pha loãng bằng nước cất10 lần trước khi dùng.

Tiêu chuẩn đánh giáchấp thuận: Không lớn hơn 50 mmcg/100 mgmcg protein (. Phụ lục 15.42).

* Hàm lượng Polysaccharide :

Nguyên lý:

Polysaccharide có trong mẫu thử được chuyển thành đường đơn, sau đó phản ứng với anthrone tạo thành hợp chất màu. Đo hợp chất màu này ở bước sóng 620 nm, từ đó xác định hàm lượng polysacchacaride trong mẫu thử.

Tiến hành

Pha loãng dung dịch glucose chuẩn 500 mcg/mlbằng nước cất thành các nồng độ 2,5; 5,0; 7,5; 10,0; 12,5 mcg/ml. Mẫu thử được điều chỉnh bằng nước cất để có nồng độ protein khoảng 200 mcg/ml.

Hút 1 ml  mẫu thử và mỗi dung dịch glucose chuẩn vừa pha loãng trên vào ống nghiệm, thêm 4 ml dung dịch anthrone 0,2%, lắc đều, đun cách thủy 100°C trong 15 phút. Làm nguội nhanh trong nước đá và để ở nhiệt độ phòng trong 60 phút. Đo quang phổ bước sóng 620 nm, dựng đường chuẩn, từ đó tính ra hàm lượng polysaccharide trong mẫu thử.

Đơn vị tính : mcg/100 mcg protein.

Cách pha các dung dịch:

- Dung dịch glucose chuẩn 500 mcg/ml: Hòa tan 50 mg glucose bằng nước cất trong bình định mức 100 ml, thêm nước cất vừa đủ. Trước khi dùng, pha loãng 10 lần bằng nước cất.

- Dung dịch anthrone 0,2% (w/v): Cân 0,2 g anthrone chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm acid sulfuric 95% vào vừa đủ. Bảo quản dung dịch ở 2-10°C trong chai thủy tinh màu, sử dụng 2 tuần sau khi pha.

Tiêu chuẩn đánh giáchấp thuận: Không lớn hơn 10 mmcg/100 mgmcg protein (. Phụ lục 15.38).

 

CHUYỂN SANG CHUYÊN LUẬN CHUNG !!! Nhưng những thử nghiệm này chỉ dùng riêng cho vx VGB ?

* Vô khuẩn

Đạt yêu cầu về tính vô khuẩn. Phụ lục 15.7

Kiểm định vacxinvắc xin bán thành phẩm cuối cùng

* Hàm lượng Thimerosal :

Không được lớn hơn 0,012 g% (. Phụ lục 15.29).

* Vô khuẩn :

Đạt yêu cầu về tính vô khuẩn (. Phụ lục 15.7).

 

Kiểm định vacxinvắc xin thành phẩm

* Cảm quan:

 

 Sau khi lắc, vacxinvắc xin viêm gan B có màu trắng, hơi đục.

* pH: Ttrong khoảng  5,4 - 7,4 ( . Phụ lục 15.33).

*Hàm lượng Protein toàn phần :

Xác định bằng phương pháp Lowry. Hàm lượng protein toàn phần có trong vacxinvắc xin không được quá 40 mcg/ml (. Phụ lục 15.34).

* Hàm lượng nhôm :

Hàm lượng nhôm trong vacxinvắc xin tối đa không được quá 1,25 mg/1 liều đơn dùng cho người (. Phụ lục 15.27).

* Hàm lượng Formaldehyd: Không được quá 0,01 g%  (. Phụ lục 15.25).

* Hàm lượng Thimerosal: Không được quá 0,012 g%  (. Phụ lục 15.29).

* Vô khuẩn: Đạt yêu cầu về tính vô khuẩn (. Phụ lục 15.7).

*An toàn chung :

VacxinVắc xin viêm gan B phải đảm bảo an toàn khi thử nghiệm trên chuột lang và chuột nhắt trắng. Chuột phải khoẻ mạnh và tăng trọng bình thường sau 7 ngày theo dõi. ( Phụ lục 15.11).

* Chất gây sốt

:

VacxinVắc xin viêm gan B phải an toàn về mặt chất gây sốt khi tiêm cho thỏ. Tổng nhiệt độ chênh lệch 3 thỏ không được quá 1,3 ⁰C (. Phụ lục 15.12).

* Công hiệu:

Công hiệu vacxinvắc xin viêm gan tái tổ hợp được tiến hành song song giữa vacxinvắc xin mẫu thử với vacxinvắc xin mẫu chuẩn quốc gia; có thể được xác định bằng phương pháp thực nghiệm trên động vật thí nghiệm (công hiệu in vivo) để xác định hiệu giá kháng thể, hoặc phương pháp miễn dịch trên labo (công hiệu in vitro) để xác định hàm lượng kháng nguyên HBsAg có trong vacxinvắc xin.

 

Thử nghiệm công hiệu trên động vật thí nghiệm ( in vivo):

Động vật thí nghiệm:

Chuột nhắt trắng giống BAlLB/C  hoặc ICR, khoẻ mạnh và từ cùng một đàn, khoảng 5 - 6 tuần tuổi, tốt nhất là chuột cùng một giới.

Xác định công hiệu tương quan:

VacxinVắc xin mẫu chuẩn quốc gia và vacxinvắc xin mẫu thử được pha loãng bậc 2 thành 5 độ pha. Dung dịch để pha vacxinvắc xin là nước muối sinh lý có chứa nhôm hydroxyt hydroxyd nhôm (hàm lượng nhôm hydroxyd hydroxyt nhôm không quá 500 mcg/ml). Tiêm 1 ml mỗi độ pha loãng vacxinvắc xin cho mỗi chuột, đường tiêm: Mmàng bụng. Mỗi độ pha loãng vacxinvắc xin tiêm ít nhất 15 chuột. Tất cả các chuột sau gây miễn dịch được nuôi từ 28 - 32 ngày trong điều kiện như nhau. Tiến hành gây mê và lấy máu tim chuột. Các mẫu máu được ly tâm 3000 vòng/phút ở nhiệt độ 4 ⁰C -- 8 ⁰C, tách huyết thanh. Các mẫu huyết thanh được bảo quản riêng rẽ trong các tuýp eppendorf ở nhiệt độ - 20 ⁰C.  Việc xXác định hiệu giá kháng thể kháng HBsAg được tiến hành bằng thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn men (ELISA) trên bộ kit sinh phẩm chẩn đoán thương mại có sẵn. Kết quả được tính theo chương trình Probit Analysis (WHO).

Thử nghiệm có giá trị khi:

ED₅₀ của vacxinvắc xin mẫu chuẩn quốc gia và vacxinvắc xin mẫu thử đều nằm trong khoảng giữa liều tiêm lớn nhất và nhỏ nhất.

Phân tích thống kê cho thấy đạt yêu cầu về tuyến tính và song song.

Giới hạn độ tin cậy của công hiệu tương quan nằm trong khoảng 33% đến 300%.

Tiêu chuẩn công hiệu trên thực nghiệm:

Công hiệu tương quan (P = 95%) không nhỏ hơn 1.

 

Thử nghiệm công hiệu  in vitro

VacxinVắc xin thử nghiệm được pha loãng song song với vacxinvắc xin mẫu chuẩn quốc gia bằng PBS 0,1M với các độ pha loãng bậc 2 phù hợp. Tiến hành thử nghiệm bằng kỹ thuật ELISA, trên bộ kít sinh phẩm chẩn đoán thương mại có sẵn. Dùng kháng thể đơn dòng kháng HBsAg để xác định lượng kháng nguyên HBsAg trong vacxinvắc xin mẫu thử, so sánh với vacxinvắc xin mẫu chuẩn.

Kết quả được tính theo chương trình Paralelline (WHO).

Tiêu chuẩn chấp thuận:

Công hiệu tương quan (P = 95%) không nhỏ hơn 0,65.

 

Nhãn

Theo thông tư số 14/2000/TT-BYT ngày 22-6-2000 và  của Cục Y tế dự phòng, thông tư số 14/2001/TT-BYT ngày 26-6-2001 của Bộ Y tếCục quản lý dược.

Chỉ định, liều dùng

Đường dùng: Tiêm bắp vào vùng cơ delta (đối với trẻ sơ sinh tiêm bắp đùi tốt hơn).

Người lớn: 1,0 ml loại 20 mmcg/1 ml. Tiêm 3 mũi. Lịch tiêm: 0, 1, 6 tháng.

Trẻ em dưới 10 tuổi: tiêm 0,5 ml loại 20 mmcg/1 ml. Tiêm 3 mũi. Lịch tiêm: 0, 1, 6 tháng.

Trẻ sơ sinh mũi đầu: 0,5 ml loại 5 mmcg/1 ml. Tiêm 4 mũi. Lịch tiêm: 0, 1, 2, 12 tháng.???

Tiêm nhắc lại sau 5 năm đối với tất cả các lứa tuổi.

Đóng gói, bảo quản

VacxinVắc xin viêm gan B được đóng trong lọ thủy tinh trung tính, mỗi lọ chứa 20 mmcg/1 1 ml/lọ; hoặc 10 mmcg/ 1 ml/lọ; hoặc 5 mmcg/1 ml/lọ (đối với vacxin tiêm chủng mở rộng),  tùy theo từng nhà sản xuất.

 

Bảo quản

VacxinVắc xin viêm gan B phải được bảo quản ở nhiệt độ 2 -- 8 ⁰C, tuyệt đối không được làm vacxinvắc xin đông băng.

 

Tính ổn định và Hhạn dùng

Nghiên cứu tính ổn định của vắc xin phải được tiến hành trên ít nhất 3 loạt liên tiếp (được sản xuất từ 3 loạt bán thành phẩm khác nhau) khi được bảo quản theo thời gian ở điều kiện như ghi trên nhãn của sản phẩm.

Trong điều kiện bảo quản như trên, vacxinvắc xin viêm gan B tái tổ hợp có hạn dùng là 36 tháng.

 

Nhãn, hộp

Những thông tin  đối với nhãn, hộp, tờ hướng dẫn sử dụng phải đáp ứng những yêu cầu quy định trong Thông tư số 04/2008/TT-BYT, ngày 12/5/2008 của Bộ Y tế về Hướng dẫn ghi nhãn thuốc.

 

Các thông tin cần thiết trên nhãn lọ, hộp và giấy hướng dẫn sử dụng phải tuân thủ theo thông tư số 14/2000/TT-BYT ngày 22-6-2000 và thông tư số 14/2001/TT-BYT ngày 26-6-2001 của Bộ Y tế.

Chỉ định, liều dùng

Đường dùng: Tiêm bắp vào vùng cơ delta (đối với trẻ sơ sinh tiêm bắp đùi tốt hơn).

Liều dùng, lịch tiêm: Ttheo hướng dẫn cụ thể của nhà sản xuất.

Tiêm nhắc lại sau 5 năm đối với tất cả các lứa tuổi.