15.32. XÁC ĐỊNH NITROGEN TRONG VẮC XIN
VÀ SINH PHẨM
Nguyên lý
Phương
pháp dựa vào tính chất của thuốc thử Nessler cho
phản ứng màu với ion amoni (NH4+)
được tạo thành sau khi vô cơ hoá các chất
protein.
Phương pháp tiến hành
a. Chuẩn bị mẫu
thử:
Cho
1ml chế phẩm và 1ml dung
dịch acid tricloracetic 20% (TT) vào một ống ly tâm 10ml,
để ở nhiệt độ 4 đến 8 oC
trong 10 đến 12 giờ. Sau đó ly tâm 3500 vòng/phút trong 1
giờ, loại bỏ nước nổi. Rửa tủa
bằng 2ml dung dịch acid
tricloracetic 5%, tiếp tục ly tâm 3500 vòng/phút trong 1
giờ, loại bỏ nước nổi. Thêm vào cặn 0,2ml
acid
sulfuric đậm đặc (TT) đem vô cơ hoá trên
bếp cát cho đến khi dung dịch mất màu.
Để tăng tốc độ phản ứng
thỉnh thoảng cho vài giọt dung dịch oxy già (H2O2)
đậm đặc vào ống đốt sau khi làm nguội.
Khi chế phẩm đã được vô cơ hoá hoàn toàn,
dung dịch mất màu, thêm nước cất 2 lần vào
đủ 10ml, thu được dung dịch A.
Lấy
1ml dung dịch A vào ống nghiệm, thêm 8,5 ml nước cất 2 lần và
0,5ml thuốc thử Nessler,
được mẫu thử.
b. Song song tiến hành làm
mẫu trắng gồm:
9,5ml nước cất 2 lần và 0,5ml thuốc thử
Nessler.
c. Song song tiến hành dựng
đường chuẩn:
Hút
dung dịch amoni sulfat chuẩn có hàm lượng 0,05 mg nitrogen/ml
vào các ống nghiệm theo thứ tự sau: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4;
0,5; 0,6; 0,7 ml. Thêm nước
cất 2 lần vừa đủ 9,5 ml và 0,5 ml thuốc thử Nessler.
Lắc
đều các ống nghiệm.
Đo
mật độ quang (Phụ lục 4.1) ở bước
sóng 420 nm.
Vẽ
đồ thị đường chuẩn.
Lượng
nitrogen protein trong chế phẩm được tính theo công
thức sau:
Trong
đó:
a: Lượng
nitrogen tìm được trên đường chuẩn (mg).
6,25: Hệ số chuyển đổi
nitơ thành protein.
10: Độ pha loãng dung dịch vô cơ
hóa (ml).
1,0: Lượng mẫu
thử đem so màu (ml).
1,0:
Lượng
mẫu thử đem tủa rồi vô cơ hóa (ml).
1000: Hệ
số chuyển mg thành mg.
Cách pha dung dịch amoni sulfat
chuẩn có hàm lượng nitrogen 0,05mg/ml
Cân
0,2375g amoni sulfat (đã
được sấy khô trong bình hút ẩm bằng silicagel
đến trọng lượng không đổi), hoà tan vào
vừa đủ 500 ml nước
cất 2 lần. Dung dịch vừa pha có hàm
lượng nitrogen 0,1mg/ml, trước khi dùng pha loãng
gấp đôi bằng nước cất 2 lần.
Tiêu chuẩn cho phép
Hàm
lượng nitrogen protein trong vắc xin và sinh phẩm tùy
theo yêu cầu đối với từng loại mẫu
thử.